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  厄爾多思2 2017-03-19 00:00:00

  半定量pcr內參基因擴增條件和目的基因擴增條件一樣 以參照物為標準，對PCR終產物進行分析或對PCR過程進行監測，從而達到評估樣本 中靶基因的拷貝數，稱為定量PCR.根據反應體系是否設有參照物以及是否與標本在同一管中進行擴增，定量PCR可分為四種： ①有限稀釋法，即倍比稀釋法：通過稀釋陽性樣品直至靶基因不能再擴增為止，來設置已知濃度的參照品；根據陽性結果的Z大稀釋度及內參標或外參標的極限檢出底線，計算出待檢標本中原始模 板的分子數；利用Z大稀釋度來進行標本核酸定量時的注意點.優點是不需要特殊設備，缺點是擴增反應條件要標準化，嚴格注意污染，避免假陽性的產生. ②使用 外參照物的定量PCR，以已知濃度的目的基因為模板，按一定的倍比稀釋，然后做出標準曲線圖，未知的標本按這標準曲線找出對應的拷貝數.熒光定量PCR通 常使用該法做標準曲線. ③使用非競爭性內參照物的定量：PCR反應條件同樣，在同一試管內，用兩對引物，同步擴增來自同一DNA的一段靶序列和另一段內標 序列.通過比較兩種序列的擴增產量可對靶序列定量.方法A、設計并合成PCR擴增靶基因及無關基因的引物，優化引物配比的條件.方法B、在指數增長期實現 對靶基因及一系列已知含量無關基因的PCR擴增.方法C、PCR產物瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色.方法D、電泳條帶的紫外光下分析.方法E、二者熒光強度相等管的DNA含量亦相等.該方法只有當靶序列和內標序列以相同的量存在時，才能對兩者相對 定量；也是對處于擴增指數期的PCR產物定量. ④使用競爭性內參照物的定量PCR：同樣的反應條件，同一個試管，用同一對引物，同步擴增靶序列和內參照序 列.靶基因的量可通基本條件是靶序列和競爭性序列均用相同的引物以相同的效率擴增，兩序列的初始化比值在整個反應過程中保持不變.目的DNA 內參照DNA 變性（同一對引物）PCR競爭性模板的設置：通過改變克隆的靶基因的序列來設計競爭性模板插入新的限制性酶切位點或使原來的酶切位點缺失通過基因重組技術 插入一個與特異性蛋白結合的DNA片段，或者使靶序列發生定點誘變人工合成競爭性模板.競爭性模板設計目的：使其與靶基因的PCR擴增產物相區別（通過酶 切、雜交、顯色等手段實現）.常用的熒光定量為TaqMan探針技術，他特異的和目的片段結合，只是用的是TaqMan.半定量RT-PCR用做內參照，也應該是第三種，只是它是普通PCR，通過電泳的條帶強弱，與GAPDH的比值，分析他們的灰度值半定量，個人認為數據不可靠，應該用TaqMan做相對 定量或定量.用rt-pcr比較兩株細胞表達量的差異的時候，不一定要把兩株細胞調整為相同濃度，因為要做內參照，可以校正模板量的差異

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