反義寡核苷酸(ASOs)是一類(lèi)通過(guò)序列特異地與靶基因DNA或mRNA結(jié)合而抑 制該基因表達(dá)，從而在基因水平進(jìn)行調(diào)控的分子藥物。

圖1.反義索核苷酸作用原理。

由于以下諸多因素，寡核苷酸難以進(jìn)行LC-MS分析：

• 需要離子對(duì)試劑或非反相色譜；

• 需要小心地進(jìn)行前處理和樣品制備；

• 經(jīng)常受色譜系統(tǒng)中的消耗品和管路金屬表面相互作用的非特異性結(jié)合問(wèn)題。

沃特世新推出的高性能Xevo TQ Absolute串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀與Waters ACQUITY Premier系統(tǒng)聯(lián)用很好地解決了上述問(wèn)題。今天，就讓我們一起看看這套系統(tǒng)在反義寡核苷酸分析中展現(xiàn)出來(lái)的非凡性能吧！

圖2. Xevo TQ Absolute串聯(lián)四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)

實(shí)驗(yàn)分析

樣品準(zhǔn)備

• 標(biāo)準(zhǔn)品: 

  沃特世MassPREP寡核苷酸分離技術(shù)(OST)標(biāo)準(zhǔn)品（部件號(hào)：186004135）和寡脫氧核苷酸硫代磷酸酯GEM91 (Trecovirsen)用TE緩沖液分別配制成10 μm和1 mg/mL。

• 基質(zhì)加標(biāo)樣品：

  用血漿對(duì)儲(chǔ)備液進(jìn)行倍比稀釋。

• 樣品前處理：
  血漿樣品用苯酚：氯仿：異戊醇 25:24:1進(jìn)行液-液萃取法萃取用，然后用+99%的氯仿二次萃取。最 后，將所有水提取物干燥并在100 μM EDTA溶液中復(fù)溶。

LC-MS/MS方法

• 液相條件：

流動(dòng)相A:100mm HFIP六氟異丙醇+15mm DIPEA N, N-二異丙基乙基胺水溶液；
流動(dòng)相B:100mm HFIP六氟異丙醇+15mm DIPEAN, N-二異丙基乙基胺,80%乙腈；
色譜柱: ACQUITY Premier Oligonucleotide C18色譜柱, 130?, 1.7 μm, 2.1x50 mm(p/n:186009484)。

• 梯度條件：

質(zhì)譜條件 (ESI -):

表1. MRM通道信息。

結(jié)果與討論

靈敏度：

使用高性能Xevo TQ Absolute串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀與Waters ACQUITY Premier系統(tǒng)聯(lián)用對(duì)ASOs進(jìn)行分析時(shí)，LLOQ低至0.1 ng/mL。下圖是GEM91(m/z 597.2>319.1)、在LLOQ濃度的色譜圖，可以看到ASOs在低至0.1 ng/mL下仍表現(xiàn)出較高的靈敏度和良好的信噪比。并且在0.1 ng/mL時(shí)，多個(gè)離子對(duì)均顯示出較好的信噪比，即便碎片非常小，也獲得了非常高的靈敏度。

圖3. GEM91(m/z 597.2>319.1)LLOQ相對(duì)于基質(zhì)背景的色譜圖。

圖4. 0.1 ng/mL GEM91不同離子對(duì)色譜圖。

動(dòng)態(tài)視線范圍：

下圖為兩個(gè)ASO在0.1到10000ng/mL五個(gè)數(shù)量級(jí)的線性范圍內(nèi)的線性，可以看到兩個(gè)曲線r2大于0.99，展現(xiàn)了TQ Absolute檢測(cè)器非常好的線性范圍。

圖5. GalNac0.1到 10,000 ng/mL線性。

圖6. GEM91 0.1到10,000 ng/mL線性。

準(zhǔn)確度：

對(duì)基質(zhì)加標(biāo)工作曲線和QC樣品進(jìn)行了準(zhǔn)確度測(cè)試，結(jié)果如下表：可以看出基質(zhì)加標(biāo)工作曲線各點(diǎn)和QC樣品準(zhǔn)確度在兩個(gè)ASO不同的離子對(duì)通道都表現(xiàn)出非常好的結(jié)果，準(zhǔn)確度在87到112之間。

表2. 準(zhǔn)確度測(cè)試結(jié)果

結(jié)論

Xevo TQ Absolute能夠?yàn)榛诖?lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)的生物基質(zhì)中寡核苷酸定量的常規(guī)液相色譜生成高質(zhì)量數(shù)據(jù)。

對(duì)于反義寡核苷酸和寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品，在人血漿中觀察到0.1 ng/mL水平的靈敏度和良好的寡核苷酸動(dòng)態(tài)線性范圍性能。

在分離系統(tǒng)和分析柱中使用具有MaxPeak高性能表面(HPS)技術(shù)的ACQUITY Premier有助于減輕金屬吸附，確保定量生物分析測(cè)定穩(wěn)健和靈敏的定量性能。