KRAS（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog）基因?qū)儆赗AS基因家族，KARS基因編碼的KRAS蛋白是一種小GTP酶（small GTPase），與GTP結(jié)合呈激活狀態(tài)，與GDP結(jié)合呈關(guān)閉狀態(tài)。KRAS突變是癌癥患者中最常見的功能獲得性突變之一，占RAS突變的85%。長期以來KRAS靶向治療一直是癌癥精 準(zhǔn)治療領(lǐng)域的關(guān)鍵目標(biāo)。但由于KRAS蛋白結(jié)構(gòu)上缺乏較深的疏水性口袋，且KRAS與GDP、GTP之間具有皮摩爾級別的結(jié)合親和力，蛋白表面除了GTP結(jié)合位點(diǎn)外幾乎找不到其他小分子化合物結(jié)合口袋，因此從被發(fā)現(xiàn)以來的幾十年間，KRAS一直被認(rèn)為是不可成藥的靶點(diǎn)。

2021年5月29日，首 款KRAS靶向藥物Sotorasib（AMG510）被FDA正式批準(zhǔn)。該抑 制劑可以將KRAS G12C捕獲在其非活性構(gòu)象中并抑 制患者的腫瘤生長。然而，在癌癥中發(fā)現(xiàn)的最普遍的非G12C KRAS突變體被認(rèn)為缺乏GAP輔助的GTP水解，并且以非興奮或組成活性狀態(tài)存在。非活性狀態(tài)選擇性抑 制是否可用于治療靶向非G12C KRAS突變體仍在研究中。

2023年5月31日，來自美國紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心 ( MSKCC ) 和勃林格殷格翰（BI）公司的研究團(tuán)隊(duì)在Nature發(fā)文 Pan-KRAS inhibitor disables oncogenic signalling and tumour growth，報(bào)道了一種非共價(jià)抑 制劑的發(fā)現(xiàn)和表征，該抑 制劑優(yōu)先結(jié)合并且與KRAS的非活性狀態(tài)具有高親和力，同時(shí)不影響NRAS和HRAS，具有廣泛的治療意義。

為了開發(fā)不區(qū)分KRAS突變體的小分子泛KRAS抑 制劑，研究團(tuán)隊(duì)首先從G12C選擇性抑 制劑BI-0474中移除共價(jià)彈頭，并應(yīng)用基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)優(yōu)化以獲得有效的非共價(jià)抑 制活性。共價(jià)彈頭的移除大大降低了G12C抑 制的效力，但研究者意外發(fā)現(xiàn)，盡管效力較低，無彈頭支架不加選擇地抑 制了由KRAS突變體驅(qū)動的增殖。結(jié)合晶體結(jié)構(gòu)分析，進(jìn)一步優(yōu)化生成BI-2865，它可以抑 制表達(dá)KRAS G12C，G12D或G12V突變的BaF3細(xì)胞增殖，平均IC50約為140nM。研究者決定進(jìn)一步研究BI-2865及其相關(guān)化合物的影響，將它們稱為泛KRAS抑 制劑或KRASi。

圖1：與KRASi結(jié)合的KRAS WT，G12C，G12D，G12V和G13D突變體的共晶體結(jié)構(gòu)

為進(jìn)一步探究該抑 制劑的作用原理，研究者使用均相時(shí)間分辨熒光測定法（HTRF法）來測量核苷酸交換。將抑 制劑以10μM的三倍連續(xù)稀釋至十種不同的濃度測試，并使用Echo聲波移液系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到反應(yīng)孔中。

Echo聲波移液系統(tǒng)助力藥物開發(fā)

Echo聲波移液采用聲波液滴噴射（Acoustic Droplet Ejection，ADE）和 動態(tài)流體分析（Dynamic Fluid Analysis，DFA）技術(shù)精 準(zhǔn)轉(zhuǎn)移各種液體。移液體積低至2.5nL，可實(shí)現(xiàn)微量化檢測。直接稀釋技術(shù)可有效避免稀釋中沿曲線傳遞誤差，幫助您提高數(shù)據(jù)質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)更多有效化合物。

數(shù)據(jù)表明，無論收到核苷酸交換因子SOS1或EDTA的刺激時(shí)，結(jié)合GDP的KRAS突變體在結(jié)合抑 制劑后，依賴核苷酸交換的激活有所降低。該抑 制劑僅在高濃度（平均IC50約為5.5μM）下阻止效應(yīng)子與活性KRAS結(jié)合，并且低親和力的結(jié)合不會導(dǎo)致KRAS-GTP水解增強(qiáng)。相比之下，非活性狀態(tài)結(jié)合對核苷酸交換的抑 制作用的IC50約為5nM。數(shù)據(jù)表明，該抑 制劑在細(xì)胞中的抑 制活性主要依賴于靶向KRAS的非活性或GDP結(jié)合狀態(tài)。

圖2：KRASi處理對SOS1（d）或EDTA（e）刺激的核苷酸交換的影響

在上述實(shí)驗(yàn)中可以看到抑 制劑通過HRAS或NRAS抑 制核苷酸交換的能力比KRAS低幾個(gè)數(shù)量級。由于RAS亞型的GTP酶（G）結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化分歧很小，只有很少的非同源氨基酸存在。因此，為了確定KRAS選擇性的基礎(chǔ)，研究者對比了HRAS，NRAS和KRAS之間的氨基酸差異。實(shí)驗(yàn)表明，在RAS亞型的G結(jié)構(gòu)域中具有進(jìn)化分歧的3個(gè)殘基（Q95H/A121P/A122S）也對KRAS抑 制施加了選擇性限制。雖然僅限于幾個(gè)氨基酸，但RAS的GTP酶結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化分歧亞型足以賦予KRAS 選擇性的正構(gòu)和別構(gòu)約束。

接下來，研究者們評估了泛KRASi在一組39個(gè)細(xì)胞系中抑 制KRAS激活和下游信號傳導(dǎo)的能力。這些細(xì)胞系起源于肺癌，結(jié)直腸癌或胰 腺癌。首先將細(xì)胞接種在黑色384孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)24小時(shí)，測定ATP濃度。然后使用Echo聲波移液系統(tǒng)轉(zhuǎn)移KRASi至培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)5天后再次測定ATP濃度。正如生化數(shù)據(jù)所預(yù)期的那樣，KRASi抑 制了WT和突變模型中的KRAS激活。

Biomek液體處理好搭檔

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為了評估KRASi對下游信號傳導(dǎo)的影響，并鑒定KRAS失活后立即失調(diào)的轉(zhuǎn)錄本和路徑，研究者在使用DMSO或KRASi處理的22個(gè)模型中進(jìn)行了RNA測序。KRASi處理后差異表達(dá)的基因在KRAS突變模型之間相似，KRASi處理會抑 制MEK/ERKi下調(diào)基因，同時(shí)誘導(dǎo)MEK/ERKi上調(diào)基因。與WT KRAS相比，這種效應(yīng)在表達(dá)KRAS突變體的細(xì)胞系中更為明顯。數(shù)據(jù)表明，KRAS WT模型中缺乏下游信號抑 制可能是由于HRAS和NRAS的補(bǔ)償。

研究團(tuán)隊(duì)針對體內(nèi)給藥對BI2865進(jìn)行了優(yōu)化，BI-2493是BI-2865的結(jié)構(gòu)類似物，兩種泛KRASi與突變KRAS具有相似的結(jié)合模式和抑 制特性。體內(nèi)研究表明，BI-2493抑 制劑減弱了攜帶KRAS G12C，G12D，G12V和A146V突變模型的小鼠的腫瘤生長，而不會對小鼠造成明顯的毒性。

圖3：選擇性抑 制腫瘤信號傳導(dǎo)和KRAS驅(qū)動的腫瘤生長

綜上所述

這篇研究報(bào)告了一種泛KRAS抑 制劑，該抑 制劑通過優(yōu)先靶向KRAS的非活性狀態(tài)來防止其通過核苷酸交換重新激活。泛KRAS抑 制劑的細(xì)胞效應(yīng)表明，對非活性狀態(tài)選擇性抑 制的敏感性，并不是僅針對KRAS G12C突變體，而是可以應(yīng)用于廣泛靶向KRAS突變體的特性，后者包括G12A/C/D/F/V/S、G13C/D、V14I、L19F、Q22K、D33E、Q61H、K117N和A146V/T，它們共同構(gòu)成了癌癥中發(fā)現(xiàn)的大部分KRAS突變體。這一研究為開發(fā)更多KRAS靶向療法提供了藍(lán)圖，包括GTP結(jié)合KRAS的小分子抑 制劑和蛋白水解靶向嵌合體。