CMFDA，英文全稱5-chloromethylfluorescein diacetate，是一種可自由透過活細胞膜對細胞進行示蹤的熒光染料。

CMFDA是二乙酸熒光素（Fluorescein diacetate，FDA）的氯甲基衍生物，具細胞膜滲透性，不具有熒光發光性。當通過被動運輸穿透細胞膜進入活細胞后，CMFDA中的親脂性基團可被胞漿內非特異性酯酶水解，生成5-氯甲基熒光素（5-chloromethylfluorescein）；5-氯甲基熒光素可發出綠色熒光，  因帶電荷而不能自由穿透細胞膜，并利用自身氯甲基與細胞內蛋白和多肽中的谷胱甘肽在谷胱甘肽巰基轉移酶作用下生成加合物，能完好的保留在胞內。經CMFDA標記的細胞，熒光非常穩定，穩定標記的時間可達數天（至少3天），因此非常適用于細胞分化和形態發生等研究。與常用的鈣黃綠素和FDA相比，具有較長時間的細胞內信號保留特點。

在細胞分裂增殖過程中，CMFDA標記熒光可分配至兩個子代細胞中，且具有不會使鄰近細胞染色的功能（有極少情況下通過細胞間縫隙連接發生染色）。同時，CMFDA標記熒光還主要用于分析細胞間融合、細胞粘附及多藥耐藥轉運蛋白的研究。此外，CMFDA還可用于與其他細胞示蹤染料聯合選擇性標記感染細胞內的病原菌；與膜不通透性核熒光探針共同使用，可用于細胞活性研究。

本品具有細胞示蹤試劑理想的特性：穩定、無毒（工作濃度范圍內）、細胞內熒光保留性好、強熒光（生理pH范圍內）。CMFDA標記細胞呈綠色熒光，Ex=492 nm，Em=517 nm，可與其他顏色熒光染料，如紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP）等共染。本品以粉末形式提供，需用DMSO制備儲存液后再使用。

 

產品性質

中文名稱（Chinese Synonym）	5-氯甲基熒光素二醋酸酯
英文名稱（English Synonym）	5-chloromethylfluorescein diacetate
CAS號（CAS NO.）	136832-63-8
分子式（Molecular Weight）	C25H17ClO7
分子量（Molecular Fomular）	464.85
外觀（Appearance）	白色或類白色固體
Ex/ Em	492/517 nm
結構式（Structure）

 

運輸與保存方法

室溫運輸。-20℃干燥避光保存，有效期一年。避免反復凍融。

 

注意事項

1. 不同的細胞其細胞內酯酶活性不同，因此染色效果具有差異性。

2. 熒光染料均存在淬滅問題，染色過程需盡量避光。

3. 避免使用含有巰基的緩沖液。

4. 為了您的健康，實驗操作時請穿實驗服和帶一次性手套。

5. 本產品僅作科研用途！

 

操作方法

1. CMFDA儲存液（10 mM）的配制

將本品取出回溫至室溫。用10.8 µL DMSO溶解50 µg CMFDA，充分混勻即得到10 mM的儲存液。第一次使用時，建議母液現配現用。且溶解后的試劑盡可能在短時間內使用，以保證實驗效果。母液遇水極易分解，若單次不能用完，建議分裝保存，用封口膜封口，并嚴格做到≤-20℃密封干燥保存。【避免反復凍融】
【注】： ① 本品容易吸潮，從冰箱取出后，請確認在干燥的環境放至室溫后再開封。由于試劑極其微量，開封前請將其短暫離心，以保                     證粉末落入管底。

② 所用DMSO必須保證高質量，新鮮無水，否則將會導致醋酸酯水解，使熒光染料無法進入細胞，影響實驗效果。

③ 建議您在正式實驗前先摸索一下細胞量、熒光探針的終濃度、培養時間等，找到最佳實驗條件。

2. CMFDA工作液（0.5-5 µM）的配制

使用前用無血清培養基稀釋上述儲存液至工作液濃度（0.5-25 µM），并將探針工作液于37℃預熱。
【注】：針對不同的實驗目的所需的工作液濃度不同，需根據具體情況進行優化。一般來講：對于長期染色（至少3天）或快速分裂細胞的染色，推薦工作液濃度5-25 µM。對于短期染色，如細胞活力分析等實驗，推薦工作液濃度0.5-5 µM。為避免過度加載造成細胞毒性，維持正常的細胞生理活性，建議在取得有效結果的基礎上盡量使用最低探針濃度。

3. 染色方法

3.1 懸浮細胞染色

1）離心收集細胞，并吸除上清。用預熱的探針工作液輕柔地重懸細胞。

2）于細胞正常生長條件下孵育15-45 min。

3）離心并去除探針工作液。

4）換用新鮮培養基繼續培養30 min。

5）清洗細胞，如需固定請參考如下步驟【4.固定和通透處理】。

3.2 貼壁細胞的染色

1）吸除培養液。

2）輕輕加入預熱的探針工作液。

3）于細胞正常生長條件下孵育15-45 min。

4）換用新鮮培養基繼續培養30 min。

5）清洗細胞，如需固定，請參考后續步驟【4.固定和通透處理】。

4.（可選）固定和通透處理

4.1 固定前，細胞需用PBS充分清洗。

【注】：當細胞包被在含有巰基或蓋玻片表面上時，該清洗步驟尤為重要。

4.2 用3.7%多聚甲醛室溫固定細胞15 min。

4.3 固定后于PBS中漂洗細胞。

4.4 （可選）后續如進行其他抗體染色，需對細胞進行通透處理，可將上述處理的細胞于預冷的丙酮中孵育10 min。

5 鏡檢

將上述處理的細胞用PBS漂洗后，進行檢測。該探針呈綠色熒光，其Ex=492 nm，Em=517 nm。

 

 

HB220418