產品簡介

 

本產品是2×實時定量PCR擴增的預混合溶液。采用的抗體法熱啟動DNA聚合酶（貨號：10113ES），在預變性溫度（95℃）加熱30sec，UNICON® Taq抗體失活，釋放出Taq DNA Polymerase活性。抗體法熱啟動Taq酶可以有效抑制引物非特異性退火導致的擴增。同時，配方優化了有效抑制非特異性PCR擴增的因子和提升PCR反應擴增效率的因子，適合低濃度模板的擴增，使定量PCR可以在寬廣的定量區域內獲得良好的標準曲線。

Mix中含有Hieff® Taq DNA Polymerase、UNICON® Taq抗體、SYBR Green I、dNTPs、Mg²⁺及Low Rox。使用時，僅需在擴增體系中加入模板和引物即可進行實時熒光定量PCR，大大簡化操作過程，降低污染幾率。

 

產品信息

 

貨號	11199ES03 / 11199ES08 / 11199ES25 / 11199ES50 / 11199ES60
規格	1 mL / 5×1 mL / 5×5 mL / 10×5 mL / 20×5 mL

 

儲存條件

 

-25~-15℃避光保存，有效期18個月。本品避免反復凍融。產品中含有熒光染料SYBR Green I，保存或配制反應體系時需避免強光照射。  

 

使用說明

 

1. 反應體系（推薦冰上配制）

組分	體積 (μL)****	體積 (μL)	終濃度
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (抗體法，Low Rox)*	25	10	1×
Forward Primer (10 μM)**	1	0.4	0.2 μM
Reverse Primer (10 μM)**	1	0.4	0.2 μM
模板DNA***	X	X	-
RNase Free H2O	to 50	to 20	-

*使用前務必充分混勻，避免劇烈震蕩產生過多氣泡。

**通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據情況在0.1-1.0 μM之間進行調整。

***如模板類型為未稀釋cDNA原液，使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10。cDNA原液建議5-10倍稀釋，最佳模板加入量以擴增得到的CT值在20-30個循環為好。

****推薦使用20 μL或50 μL總體積，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。

2. 擴增程序*

1. 兩步法

循環步驟	溫度	時間	循環數
預變性**	95℃	30 sec	1
變性	95℃	10 sec	40
退火/延伸***	60℃	30 sec****
熔解曲線階段*****	儀器默認設置		1

2）三步法

循環步驟	溫度	時間	循環數
預變性**	95℃	30 sec	1
變性	95℃	10 sec	40
退火***	55-60℃	20 sec
延伸	72℃	20 sec****
熔解曲線階段*****	儀器默認設置		1

*高特異性可選擇兩步法，高效率擴增可選擇三步法。

**預變性時間可根據不同模板和引物的具體情況適當增加至3-5 min。

***退火溫度和時間請根據引物和目的基因的長度進行調整。

****熒光信號采集請按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設置，幾種常見儀器的時間設定如下：

30sec以上：Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96

31sec以上：Applied Biosystems: 7300

34sec以上：Applied Biosystems: 7500

*****熔解曲線通常情況下可以使用儀器默認程序。

3. 結果分析

定量實驗至少需要三個生物學重復。反應結束后需要確認擴增曲線及熔解曲線。

1）擴增曲線

1. Ct值落在20-30之間時，定量分析最準確；
2. Ct值小于10，需要將稀釋模板后，重新進行實驗；
3. Ct值介于30-35之間時，需要提高模板濃度，或增大反應體系的體積，以提高擴增效率，保證結果分析的準確性；
4. Ct值大于35時，檢測結果無法定量分析基因的表達量，但可用于定性分析。

2）熔解曲線

a.   熔解曲線單峰，表明反應特異性好可以進行定量結果分析；若熔解曲線出現雙峰或者多峰，則不能進行定量分析。

b.   熔解曲線出現雙峰，需要通過DNA瓊脂糖凝膠電泳判斷非目標峰是引物二聚體還是非特異性擴增。

c.   如果是引物二聚體，建議降低引物濃度，或者重新設計擴增效率高的引物。

d.   如果是非特異性擴增，請提高退火溫度，或者重新設計更高特異性的引物。

4. 引物設計指南

1） 推薦引物長度25 bp左右。擴增產物長度150 bp為佳，可以在100 bp-300 bp內選擇。

2） 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2℃。引物Tm值60℃-65℃為佳。

3)  引物堿基分布要均勻，避免出現連續的4個相同堿基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一個堿基最好為G或C。

4)  引物內部或者正反兩條引物間最好避免出現有3個堿基以上的互補序列。

5)  引物特異性需要用NCBI BLAST程序進行核對。避免引物3’端有2個堿基以上的非特異性互補。

6)  設計完成的引物需要進行擴增效率的檢測，只有具備相同擴增效率的引物才可用于定量比較分析。

5. 適用機型

Applied Biosystems: 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio Dx, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6,7,12k Flex;

Stratagene: MX3000P, MX3005P, MX4000.

 

注意事項

 

1. 推薦使用本公司cDNA合成試劑盒（Cat#11141），以有效去除RNA樣品中殘留的基因組。
2. 解凍后Master Mix可能出現絮狀物質，4℃放置并上下顛倒混勻至溶液澄清，不影響試劑性能。
3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
4. 本產品僅作科研用途。

 

Ver.CN20231128