糖化抗體分析中的色譜柱選擇

來源：東曹（上海）生物科技有限公司      分類：應(yīng)用方案 2021-03-20 11:33:50 1525閱讀次數(shù)

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抗體在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液中的葡萄糖與抗體的絲氨酸殘基、蘇氨酸殘基結(jié)合而引起糖基化反應(yīng)(Glycosylation)，以及與賴氨酸殘基產(chǎn)生Schiff堿反應(yīng)而發(fā)生糖化反應(yīng)(Glycation)。這些反應(yīng)的性質(zhì)，與抗體中Fc片段含有的寡糖鏈的性質(zhì)不同，與抗體的藥效、生理活性等沒有直接關(guān)系。

但是，抗體分子在細(xì)胞外與糖結(jié)合引起翻譯后修飾變異，表明了抗體結(jié)構(gòu)的不均一性，而在抗體藥物上，這些變異體被認(rèn)為是產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，是需要分析其特性的。

分析糖化抗體一般采用硼酸親和層析法。在不少文獻(xiàn)中都有使用親和色譜柱TSKgel Boronate-5PW來分析糖化抗體以及生物類似藥的實例。

在該文獻(xiàn)中，使用了TSKgel Boronate-5PW來分離和定量糖化抗體與非糖化抗體。從下面的色譜圖中可以看到，糖化抗體會被色譜柱吸附，非糖化抗體則直接流穿出來。

抗體發(fā)生糖化反應(yīng)時，葡萄糖等物質(zhì)與抗體表面的氨基酸殘基結(jié)合。這些糖帶有平行排列的2個羥基 (-OH；二醇基)，在堿性洗脫條件下，二醇基與硼酸結(jié)合。TSKgel Boronate-5PW利用了這個原理，把硼酸化合物鍵合在凝膠固定相上。

硼酸親和層析的原理示意圖

Boronate-5PW的使用注意事項

● 使用堿性pH的緩沖溶液。可以使用pH 8左右的HEPES緩沖溶液。但是，Tris等堿性緩沖溶液、銨鹽不可作為單一溶液使用。

● 確保有足夠的初期平衡時間(≥10CV)。

● 樣品吸附較弱時，向洗脫液中添加20-50 mmol/L的MgCl₂，有時可以讓結(jié)合更加穩(wěn)定，從而增強(qiáng)吸附能力。

● 洗脫分離受溫度影響較大，為了獲取再現(xiàn)性數(shù)據(jù)，請使用柱溫箱，在穩(wěn)定的溫度下進(jìn)行分析。

標(biāo)簽：親和色譜柱TSKgel Boronate-5PW糖化抗體分析

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